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| 孕妇外周血中胎儿细胞DNA及法医学应用前景 | |||||
作者：鲁涤 文章来源：中国司法鉴定网 点击数： 更新时间：2006-11-7  |
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1．孕妇外周血中的胎儿细胞和DNA 早在十九世纪末，德国科学家就在死于子痫的孕妇肺组织中发现过滋养细胞。但直到1979年，Herzenberg等[ 1] 才首次应用荧光活化细胞拣选法，在孕15周的HLA-A2阴性孕妇（丈夫为HLA-A2阳性）的外周血中富集出HLA-A2阳性细胞，并用Y染色体荧光标记检测进行了分析，认为这些细胞来源于胎儿。1989年Lo等[ 2]首次应用巢式PCR技术在孕妇外周血中扩增出Y特异性重复序列，并提出这一技术可以作为性相关基因疾病的产前诊断方法。之后，许多研究都证实了孕妇外周血中存在胎儿细胞和DNA。 随着胎儿特异性单克隆抗体的不断出现和细胞分离技术的发展，人们从孕妇外周血中主要发现了三种胎儿细胞： 滋养细胞（trophoblasts）：Covone等[ 3 ]应用抗H315单克隆抗体，从孕6周及其他孕期的母体外周血中分离出了三类滋养细胞（多核、双核及来自合体滋养层的无核细胞）。近年，单克隆抗体340也被成功地用于辨认和分离滋养细胞[ 4]。由于在孕第9天形成滋养层细胞的过程就开始了，因而，滋养细胞是胎儿早进入母体循环的细胞; 淋巴细胞（lymphocytes）：淋巴细胞在母体外周血中出现较晚，但存活时间可长达分娩后6个月~27年[ 5]，下次妊娠时可再次出现，故被认为不太适合于诊断或鉴定; 有核红细胞（nucleated red blood cell，NRBC）：有核红细胞在成人血循环中罕见，而在胎儿循环中普遍存在，特别是早孕期，11周时达10%，19周时为0.5%；它有独特的抗原成分，如转铁蛋白受体（CD71）、血型糖蛋白A（GPA）等可被用来分离富集胎儿细胞；其存活寿命短，一般不超过90天，不至于影响下次妊娠的诊断。因此,有核红细胞被认为是较适于诊断的胎儿细胞。Simpson等用流量细胞计数器分析获得的数据，胎儿有核红细胞与母体外周血中的有核细胞之比是1：107~108，Hall等应用免疫纯化方法（抗CD34）估计，该比例为1：4.75×106~1：6×107[6] 。可见，胎儿细胞在母体外周血中的数量很少。 在母体外周血的血浆中也可以检测到胎儿的DNA[7]。有学者认为，母体血浆中存在游离胎儿DNA，是因为胎儿对母体就如同肿瘤对机体一样，肿瘤DNA可以在血浆中检测到，那么母体对胎儿也会有免疫排斥反应，是胎儿细胞破裂将DNA释放到母体血浆中所致。 2．孕妇外周血中胎儿细胞、DNA的检出方法 在染色体水平检测胎儿细胞,主要是采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH )的方法，诊断18三体、21三体、47，XXY等染色体病，故在此不予赘述。PCR技术在检测微量胎儿细胞进行基因诊断方面表现出很大的潜力。 扩增母体外周血细胞的DNA 经过富集或未经富集的孕妇外周血，常规方法提取DNA后，用PCR方法扩增胎儿特异性DNA片断，可检测到胎儿基因。Lo等[2]用该方法检测孕妇外周血有核细胞DNA中Y特异重复序列，对9-41孕周的胎儿进行了产前性别鉴定。其方法是：采取静脉血，常规提取DNA后，振荡30分钟使DNA断裂并将胎儿DNA与母血DNA充分混合；取2ugDNA，以Y1.1和Y1.2为引物,经40循环后，再取扩增产物2ul,以Y1.3、 Y1.4为引物进行15-20个循环的扩增。结果，12名产下男婴的妇女外周血中均检出Y特异重复序列，7名产女婴的妇女均未检出。Lo等[8]还应用RhD基因特异性引物，从RhD阴性的母体外周血中成功地检测出了RhD阳性胎儿的基因型。 Camaschella等[9]还曾用孕妇外周血诊断胎儿β-地中海贫血/Hb Hepor病。 扩增母体外周血浆及血清中的DNA检测胎儿特异序列 Lo等[7]以母体血浆和血清中的DNA为模板，扩增男性胎儿单拷贝序列DNA,即DYS14基因。基本方法是：孕妇的静脉血离心,取血清/浆, 99oC加热5分钟后离心；取10ul血清/浆为模板，采用引物Y1.7和Y1.8扩增DYS14，60个循环 。结果, 孕12~14周的43名妇女，DYS14在生男孩的孕妇血浆中的检出率为80%，血清中的检出率为70%。迟洪滨等[10]用相同的引物，套试扩增孕妇外周血的血浆、血清中的DYS14基因，所报道的检出率与Lo等基本相同。 可以看出，PCR虽然不是细胞分离技术，但它能检测到母体血中极少量的胎儿DNA。Lo等[11]采用连续稀释男性胎儿DNA的方法进行评价，PCR系统可以在300,000个母体细胞中鉴别出1个男性胎儿细胞，因而其在应用孕妇外周血进行胎儿遗传物质检测方面，是极其有价值的方法。 3．胎儿细胞、DNA检出时间 Hamada等[12、13]应用FISH和Y特异片段的扩增，观察孕妇不同孕期和分娩后外周血中未经富集的胎儿细胞的出现率。他们发现，在怀孕15周以后,所有怀男胎的孕妇FIHS出现阳性信号；怀孕头三个月，胎儿细胞要少于1：100,000;三个月后逐渐增多,可达到1：10,000左右；产后1天，生男孩的孕妇血液样本中,Y阳性的细胞出现的平均频率为1：17,500 ，之后逐渐下降，至产后3个月不能检出。 Von Koskull等[14]将富集过的有核血细胞，用2,3-bisphosphoglycerate和GPA抗体鉴别胎儿细胞，在6-19孕周的13名孕妇外周血中鉴别出12份样本中有胎儿细胞，并使用Y探针FISH进行了性别鉴定。 Thomas等[15]用巢式PCR法对30例经体外受精致孕的妇女外周血扩增单拷贝Y 染色体DNA序列。观察发现，怀男胎的孕妇血中检出Y 染色体DNA序列的最早胎龄为4周5天，最迟为7周零1天，平均6周+4天。产后8周任何怀男胎的产妇均不能检出Y 染色体DNA特异序列。同时有5例以前生过男婴的妇女，此次妊娠有4例产下女婴，她们的外周血中均未检出Y 染色体DNA序列，说明在母体血中检测Y 染色体DNA序列不受前次妊娠的影响。 马旭等[ 16]同样采用套式PCR扩增Y 染色体特异锌指蛋白基因ZFY。经常规提取DNA，模板量为100ng。结果：19例怀男胎的妇女外周血中ZFY的检出随胎龄增加，6周时为53%，11周时为68.4%,14周时为95%。 从上面的研究我们可以看出，胎儿细胞和DNA在孕妇外周血中的检出时间，主要与胎龄有关，但另一方面，样本是否经过富集、检验的方法和试验条件的调整与检出也有一定的关系，致使各家结果呈现出一定的差异。 4．孕妇外周血中胎儿细胞的富集 富集（enrichment）技术是指从母体外周血中分离浓缩胎儿细胞的方法。有关研究表明，使用Y 染色体DNA特异序列扩增，对经过CD71和CPA阳性富集的样本和未经富集的母血样本进行检测，前者PCR的检出率为94%，后者为64% [17]。富集母体外周血可以增加PCR对胎儿细胞的检出率。在实践中应用的富集方法主要有： 密度梯度离心（density-gradient centrifugation）用聚蔗糖-泛影酸钠混合物作分离介质，加入孕妇外周血后离心，提出有核细胞层，其中包括胎儿有核细胞。宋杰等[18]用此法处理怀孕8~40周孕妇的外周血并经扩增Y特异序列来预测胎儿性别。共64名孕妇，33例生男婴的有28例检出Y特异谱带，灵敏度为84.85%，1例生女婴的妇女检出Y特异带,特异度为96.77%，总符合率为90.63%。 流量细胞计数仪（flow cytometry）拣选：采用这种方法，胎儿有核细胞可基于4个参量被富集，即细胞大小、细胞的颗粒程度、转铁蛋白受体和细胞表面糖蛋白分子。Price[ 19]最早应用该方法富集了胎儿细胞，并用PCR扩增Y 染色体DNA特异序列进行检测，12个男胎全部检出，女胎85%确诊。该方法日后被普遍应用，并与其他拣选方法联合应用。 荧光活化细胞拣选（fluorescence activated cell sorting，FACS ）：其原理是，制备细胞悬液后，将荧光免疫染色抗原标记在胎儿有核红细胞表面，再经过流量细胞计数仪，将胎儿细胞分离、富集出来。Bianchi等[20]用抗GPA、抗CD36和抗CD71对47名孕妇外周血进行富集，发现单独用抗GPA或其与抗CD36和抗CD71之一联用，对性别的诊断均可达到100%。 磁活化细胞拣选（magnetic activated cell sorting，MACS）：在细胞悬液中加入单核细胞抗体与靶细胞结合，再加入连接着IgG抗体的磁珠与单核细胞抗体结合，置于磁场下，便可聚集出靶细胞。如靶细胞为所需要的胎儿细胞，则称为正相拣选（positive selection）。如果靶细胞为掺杂的污染细胞，留下的为所需的胎儿细胞，则称为负相拣选（negative selection）。Steele等[17]先进行密度梯度离心，再用MACS，对18ml母体血进行富集，共得到3×104个有核细胞，其中胎儿细胞占10~20个。 电荷流式分离（charge flow separation，CFS）：CFS设备为一个水平槽，其中液体的梯度与电场方向相反。细胞垂直于液体梯度和电场流动，根据细胞表面电荷密度的特点，不同类型的细胞被彼此分离并集中，通过不同的管道进入收集管。Wachtel等[21]应用该设备并经FISH证实，从20ml母体血中分离出2000多个胎儿有核红细胞。 好的富集技术，可以产生出最大纯度为10%的胎儿细胞[17]，但一般情况下，从正常孕妇外周血中得到的胎儿细胞要少于0.1%。因此，改进富集技术是至关重要的。提高胎儿有核细胞比例，不但会提高PCR的准确率，还可能扩大应用孕妇外周血对胎儿进行遗传分析的领域。 5．法医学应用前景 法庭科学通过DNA分析技术主要希望解决两个问题，一是个人识别，二是亲子鉴定。早孕期亲子鉴定在实际工作中虽不多见，但却一直是鉴定中的难点问题。应用早孕期活检绒毛进行亲子鉴定是一个可行的办法[22]，但其归根结底，是有创性的取材手段，而且需要一定的医疗条件方可开展取绒毛膜手术，因而取材较为困难，应用受到限制。倘若我们能对孕妇外周血中的胎儿细胞进行DNA分析，则可解决这一问题。 临床工作中，将孕妇外周血中的胎儿细胞应用于产前基因诊断所遇到的主要问题是胎儿有核细胞分离纯化困难，应用相关引物或探针只能有效地检测到母亲没有、胎儿具有的基因或DNA片段，如：Y染色体特异序列或重复序列，以及检测RhD阴性母亲所怀的RhD阳性胎儿基因,使临床应用受到限制。法医学应用也是如此。好在，目前法庭DNA分析中，Y染色体多态性位点的发现及分型技术有了长足的进步，已有足够的Y染色体多态性位点可用于法庭DNA分析和亲子鉴定[23~25]，故采用孕妇外周血中的胎儿有核细胞或DNA对男性胎儿进行孕期亲子鉴定，在目前来讲，应该是可行的。 对女性胎儿的检测则需要富集一定纯度的胎儿有核细胞，如同法医物证中的混合样本那洋，若用常染色体STR位点检测，则可能分析出2-4个基因条带，以母亲非富集血或毛根细胞DNA作对照，可分析出生父基因，因而，对女胎进行父权鉴定也不是不可能的事情。 总的来讲，孕妇外周血中胎儿有核细胞在法庭科学中的成功应用有赖于胎儿细胞分离富集技术的发展和检测方法的改善。
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